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产品编号：KD1193-5T或KD1193-10T(由A盒和B盒组成)
储存条件：A盒，-20℃储存；B盒，常温储存。
产品组成
产品简介
本试剂盒主要通过纤维素酶和离析酶配制的酶解液消化植物细胞壁获得原生质体。适用于从短日照培养或者生长在培养皿内的番茄幼苗叶片中分离原生质体。获得的细胞可用于蛋白的亚细胞定位，验证蛋白间的相互作用，研究蛋白的转录调控等。本试剂盒包含原生质体制备和转化所需的全部试剂，照每次20mL酶解液的使用量，可供5次(5T)/10次(10T)实验。
使用说明
一、准备工作
1.需要准备的材料(本试剂盒不提供)
锋利刀片、血球计数板、50mL离心管和2mL离心管。
2.酶解液配制(现配现用)
二、原生质体的分离制备
1.以短日照条件下(日照时间<12h)，大约培养4～5周的番茄幼苗叶片为试材(2～3g)。在超净工作台中进行操作，将去叶片切成0.5～1mm宽的细条，置于烧杯内，加入20mL酶解液，抽真空10min，于黑暗条件下40rpm/min，28℃震荡酶解4~5h。(酶解完成后，可取一滴酶解液镜检，原生质体呈现圆球形，叶绿体分散在整个细胞内，说明状态较好；如呈现不规则形状，说明原生质体破碎或即将破碎，如细胞扁而发黑，则弃去。)
2.酶解后的产物用细胞筛过滤，用无菌镊子或枪头轻轻搅拌，充分释放原生质体。用10mL预冷的溶液II(W5 solution)冲洗酶解器皿和未消化的叶片1～2次，将所有的液体收集到50mL离心管中。
注：操作过程中动作尽可能轻柔，避免剧烈震荡，防止原生质体破碎。
3.选用水平转头，室温100g离心2min，升速3，降速3，去除上清。
注：去除上清液体时最好用移液枪，避免采用倒的方式。离心时，可调低离心机的升速和降速。升速过快，原生质体可能离到管壁上；降速过快，可能导致管底原生质体悬起。建议升速和降速都使3。
4.加入5～10mL预冷的溶液II(W5 solution)，用蓝枪头(剪掉尖端)轻轻悬起原生质体，室温100g离心2min，升速3，降速3，去上清。
5.加入1mL预冷的溶液II(W5 solution)，用蓝枪头(剪掉尖端)轻轻悬起原生质体，转移至2mL圆底离心管，冰上静置30min。
6.显微镜下观察原生质体状态并用血球计数板计数。注：原生质体呈现圆球形，叶绿体分散在整个细胞内，说明状态较好；如呈现不规则形状，说明原生质体破碎或即将破碎。如果细胞量较少(少于2×105个/mL)，可以将所有细胞用于1～2个转化体系。
7.室温100g离心2min，升速3，降速3，去上清。加入适量溶液III(MMg solution)溶液重悬原生质体，调整浓度为1～2×105个/mL。
血球计数板的使用：
如下图所示，在血球计数板上加上一个盖玻片，分别从两侧凹槽加入样品。使用中央区域长和宽都是1mm的方形区域进行计数(25个中方格)。分别统计正方形四个顶角和中央的小正方形的细胞数量，取平均值再乘以25(正方形被分成了25个小正方形)，计算该区域的细胞数量，该区域的体积为0.1μL(长1mm，宽1mm，高0.1mm)。计算获得的细胞数量。原生质体浓度(个/mL)=25个中方格原生质体数×104×稀释倍数。
三、原生质体的转化
1.在2mL的圆底离心管中加入20μL(10～20μg)纯化后的质粒，随后加入200μL原生质体，轻轻混匀，再加入220μL溶液IV(PEG solution)，轻轻旋转离心管，或使用剪去尖头的蓝枪头(1mL吸头)轻轻吸打，直至混匀，此过程中避免产生气泡，室温放置5～30min。(常规实验约需15min，间歇轻柔混匀)。
2.加入0.8mL溶液II(W5 solution)，轻柔混匀，终止转化。常温100g离心1min，升速3，降速3，在不损失原生质体的情况下，尽可能多去除上清。
四、原生质体的培养和收集
1.加入1mL溶液II(W5 solution)悬浮细胞。将离心管水平放置于培养箱中(26～28℃)，避免强光照，孵育16~36h。
2.收集细胞时，缓慢将离心管拿起，用枪头轻柔的将附着在管壁上的细胞悬起，离心管室温垂直静置几分钟后再离心，100g离心2min，升速3，降速3，去除大部分溶液II(W5 solution)，富集细胞，用于后续实验。
注意事项
1.分离制备的原生质体没有细胞壁保护，非常脆弱，整个实验操作过程中动作尽可能的轻柔。
2.为了避免原生质体离心时贴在管壁，建议整个实验过程使用平角转头。
3.实验过程中尽可能使用剪去尖头的蓝枪头(1mL吸头)，因为其尖端的孔径较大；或把黄色枪头的尖端剪掉，并保证平滑。
番茄原生质体镜检图(10×10倍)
相关搜索：番茄原生质体制备及转化试剂盒(20 mL/T)